北京中医药大学研究生，北京中医药大学研究生院
摘 要：目的 基于斑马鱼模型，通过生化指标、病理组织学、体内细胞凋亡检测和分子生物学技术整合评价模式对吴茱萸提取物肝毒性进行综合评价。方法 给予亚致死剂量（＜lc10）下的吴茱萸提取物24h，测定丙氨酸氨基转移酶（alanineaminotransferase，alt）和天冬氨酸氨基转移酶（aspartic aminotransaminase，ast）活性，观察斑马鱼肝脏病理组织，吖啶橙（aeridineorange，ao）染色观察肝脏细胞凋亡状态，结合蛋白质印迹法westernblotting、实时定量聚合酶链反应（real-timequantitative polymerase chain reaction，rt-qpcr）和代谢组学初步探究吴茱萸毒性机制。结果 给予吴茱萸提取物后，斑马鱼ast、alt活性均显著升高，肝脏病理组织苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosinstaining，he）染色及ao染色观察提示斑马鱼肝脏受损，细胞凋亡增加，相关凋亡基因和蛋白表达水平显著上升，非靶向代谢组学结果表明吴茱萸提取物影响斑马鱼氨基酸代谢。结论 通过斑马鱼模型整合评价方法从多水平、多角度、多指标实现吴茱萸诱导肝毒性的综合评价，为斑马鱼在中药肝毒性评价的适用性提供了支撑。
吴茱萸为芸香科植物吴茱萸euodiarutaecarpa (juss.) benth.、石虎e. rutaecarpa (juss.) benth. var. officinalis (dode) huang 或疏毛吴茱萸e. rutaecarpa (juss.) benth. var. bodinieri (dode) huang 的干燥近成熟果实[1]，有小毒。现代药理研究表明，吴茱萸具有肝脏毒性，给予小鼠60 g/kg以上剂量的吴茱萸水煎剂可引起肝脏指标异常，血清中转氨酶活性和丙二醛（malondialdehyde，mda）水平显著升高，组织病理学观察肝脏可见明显的肝组织肿胀和脂肪变性[2]，大鼠单次给予吴茱萸70%乙醇提取物生药量60 g/kg，可引起血清中转氨酶活性和肝脏指数增加，组织病理学观察到大鼠中央静脉周围肝细胞变性、坏死[3]。以上均提示吴茱萸提取物单次大剂量给药可造成肝损伤。此外，也有吴茱萸与其他药物配伍应用造成肝毒性的报道[4]。目前，用于研究肝毒性中药的动物模型主要是大鼠和小鼠，成本高、周期长，难以进行规模化筛选，而斑马鱼模型兼具体外细胞高通量优势以及体内动物模型的生物复杂性特点，在筛选和评价药物毒性方面具有独特的优势。本研究以肝毒性中药吴茱萸为例，结合表型、病理生化指标、分子生物学水平及代谢组学综合评价斑马鱼作为高通量动物模型用于快速筛选肝毒性药物的适用性。
1 仪器与材料
1.1 试剂与药材
本实验中质谱甲醇（批号l-21104）和正己烷（批号l-18419）购自thermo fisher公司；mstfa衍生化制剂（批号24589-78-4）购自merck公司；实验用超纯水（18.2m）由装备有液质联用的过滤专用头（lc-ms pak）的millipore reference 超纯水系统（美国billerica公司）制备；trizol universal reagent（批号s7130）、fastking cdna第一链合成试剂盒（批号lot#r7026）均购自于北京天根生化科技有限公司；transstart top green qpcr supermix（批号lot#o11120）购自于全式金生物技术有限公司；天冬氨酸氨基转移酶（aspartic aminotransaminase，ast）和丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，alt）试剂盒均购自于南京建成科技有限公司，批号分别为20201029、20201103；苯甲基磺酰氟（pmsf）蛋白酶抑制剂、ripa裂解液、bca蛋白定量试剂盒、10% sds溶液、5×tris-甘氨酸电泳缓冲液（lot:204m040611）、10×tbst缓冲液、5×蛋白上样缓冲液、10×丽春红染液、山羊抗兔igg（h＋l）- alexa. fluor（de0635）均购自于拜尔迪生物技术有限公司；caspase-3抗体（ab13847，abcam公司）；chcl3（批号20181107）、nacl（批号20201201）、k2hpo4（批号20200320）、kh2po4（批号20130117）、nahco3（批号20200818），均为分析纯，购于北京化工厂；mgso4（批号z13o11y127224）、cacl2（批号z05n11y130022）均为分析纯，购于上海源叶生物科技有限公司。吴茱萸药材购于安国圣山药业有限公司，由北京中医药大学刘春生教授鉴定为芸香科植物吴茱萸e.rutaecarpa (juss.) benth.的干燥近成熟果实。
1.2 仪器
气相色谱-飞行时间质谱联用仪（gc-tof/ms，美国leco corp.公司）；v16体式荧光显微镜（卡尔·蔡司公司股份公司）；stemi508体式显微镜（卡尔·蔡司公司股份公司）；斑马鱼养殖系统（北京爱生生物科技有限公司）；酶标仪（gene5，gene公司）；tgl-16m型高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；gtr10-2型低速冷冻离心机（北京时代北利离心机有限公司）；wh-90a微型漩涡混悬器（上海振荣科学仪器有限公司）；chemidoc mp荧光成像系统、cfx96 real-time pcr system（bio-rad公司）；全自动组织匀浆器（next advance，inc.，averill park公司）；自动进样玻璃瓶（美国agilent technologies公司）；scientz-10n型超低温冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。
1.3 实验动物
正常野生ab型斑马鱼，鱼龄约3个月，雌雄各半，亲本购于中国科学院水生生物研究所，由本实验室饲养繁殖。
2 方法
2.1 吴茱萸提取物“量-毒”曲线的建立
2.1.1 吴茱萸提取物的制备 吴茱萸药材粉碎后过40目筛，称取适量粉末，加入10倍量蒸馏水提取2次，每次提取2 h，滤过，滤液合并后5000 r/min离心30 min，取上清液，浓缩，真空干燥，得到吴茱萸提取物粉末，并按照《中国药典》2020年版方法进行质控。取用时，称取一定量的吴茱萸提取物粉末进行研磨，溶于50 ml胚胎培养水中，超声30 min。
2.1.2 吴茱萸提取物“量-毒”曲线的建立 随机选取受精后4 d（4 days after fertilization，4 dpf）的斑马鱼幼鱼置于12孔板中，每孔20尾，分别暴露于一系列不同浓度的吴茱萸提取物中，以斑马鱼培养水为对照组，每组设置4孔重复。暴露过程于28 ℃恒温培养箱中进行，每隔8 h统计各组的斑马鱼死亡数量并及时移除死亡幼鱼。24 h后统计每组的死亡率，绘制吴茱萸提取物对斑马鱼幼鱼的“量-毒”曲线，计算10%致死浓度（lc10）。
2.2 肝功指标评价
随机选取4 dpf斑马鱼幼鱼暴露在亚致死浓度（＜lc10，600、700、800 μg/ml）下的吴茱萸提取物溶液中24 h，同时设置对照组（斑马鱼培养水），到达暴露终点时，用斑马鱼培养水清洗3次后每组收集80尾幼鱼样本，于pbs（1∶9）中匀浆，2500 r/min离心10 min，取上清液按照试剂盒说明书操作，测定alt和ast的活性。
2.3 肝脏病理组织学评价
随机选取4 dpf斑马鱼幼鱼暴露在亚致死浓度（840 μg/ml）下的吴茱萸提取物溶液中24 h，同时设置对照组（斑马鱼培养水），到达暴露终点时，将斑马鱼样本转移至4%多聚甲醛缓冲液中，室温保存。然后在乙醇中逐步脱水，石蜡包埋，切成4～5 μm的薄片后进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，he）染色，置于显微镜下观察吴茱萸提取物暴露处理后的斑马鱼肝脏组织病理状态。
2.4 体内细胞凋亡评价
随机选取4 dpf斑马鱼幼鱼暴露在亚致死浓度（840 μg/ml）下的吴茱萸提取物溶液中24 h，同时设置对照组（斑马鱼培养水），到达暴露终点时，移除吴茱萸提取物药液，快速加入5 μg/ml ao 2 ml，避光染色20 min后，收集斑马鱼样本，固定，在荧光显微镜下观察和拍照，评价吴茱萸提取物对肝细胞凋亡的影响。
2.5 rt-qpcr检测细胞凋亡因子表达水平
随机选取4 dpf斑马鱼幼鱼暴露在亚致死浓度（＜lc10，600、700、800 μg/ml）下的吴茱萸提取物溶液中24 h，到达暴露终点时，实验暴露终点以每组80尾斑马鱼进行收样，trizol法提取斑马鱼总rna。按照反转录和定量试剂盒中的操作说明分别进行反转录和荧光定量pcr反应，采用2−δδct法计算半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、caspase-8和caspase-9的基因转录水平。引物序列见表1。
2.6 western blotting测定凋亡蛋白caspase-3表达水平
预冷ripa蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂，蛋白抽提开始前加入适量0.1 mol/lpmsf母液以保证最终的pmsf浓度为1 mmol/l。准确称取定量的样本组织并置于冰水混合物中，按照1∶9比例加入裂解液，电动组织匀浆器进行匀浆。孵育20 min后，4 ℃、3000 r/min离心20 min，取上清。按照bca法进行蛋白定量，通过ripa调整蛋白浓度，煮沸变性5 min。取20 μg总蛋白上样进行胶电泳，湿转法转膜，3% bsa-tbst封闭30 min。3% bsa-tbst与一抗以1∶50比例进行稀释，4 ℃孵育过夜；5%脱脂奶粉-tbst稀释二抗山羊抗兔igg（h＋l）hrp（1∶10 000），室温孵育40 min，添加ecl后反应3～5 min，依次曝光、显影、定影。
2.7 数据处理及分析
采用spss 20.0统计软件进行统计分析，数据以表示。采用单因素方差分析，p＜0.05被认为具有统计学意义。
2.8 gc-tof/ms代谢组学评价
2.8.1 样品处理 随机选取4 dpf斑马鱼幼鱼暴露在亚致死浓度（840 μg/ml）下的吴茱萸提取物溶液中24 h作为实验组，设置对照组（斑马鱼培养水）。到达暴露终点时，精确称量25 mg待测斑马鱼样品，研磨混匀后加入80 μl预冷的50%甲醇溶液，置于全自动组织匀浆器进行匀浆。匀浆后4 ℃、13 500 r/min离心20 min，转移上清液。在残余蛋白沉淀物中精密加入200 μl预冷的甲醇-氯仿（3∶1）混合溶液再次匀浆。合并2部分上清液，再次离心20 min。精密移取200 μl上清液置于真空离心浓缩仪中除去溶剂，最后将样品冻干；恢复室温后，充入高纯度氮气保护，自动压盖保存；通过加样臂自动加入20 mg/ml甲氧胺吡啶溶液50 μl，30 ℃条件下孵育2 h；加入50 μl mstfa于37.5 ℃孵育1 h。
2.8.2 gc-tof/ms检测条件 采用gc-tof-ms进行非靶向代谢组学检测。rxi-5ms气相色谱柱（30 m×250 µm，0.25 µm）；升温程序（80 ℃保持2 min后以12 ℃/min升至300 ℃，保持4.5 min，后以40 ℃/min升至320 ℃并保持1 min）；前进样口温度270 ℃；进样量1.0 μl；传输接口温度270 ℃；离子源温度220 ℃；电离电压−70 ℃；扫描速率为25每秒光谱；质量范围m/z50～550。
2.8.3 数据分析和统计 由gc-tof/ms产生的原始数据通过chroma-tof软件自动输出到非靶向代谢组学软件xploremet中，进行基线平滑和矫正、去卷积、原始色谱峰信号提取和对齐、保留指数矫正、代谢物鉴定、数据预处理。采用正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，opls-da）统计方法区分对照组和实验组组间代谢谱差异。
2.8.4 差异代谢物筛选及代谢通路富集分析 采用hypergeometric算法将代谢物进行京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，kegg）代谢通路富集，以变量投影重要性指标（variable importance in projection，vip）＞1，p＜0.05的代谢物作为差异代谢物进行通路富集分析，加强代谢物的贡献，寻找关键代谢网络。
3 结果
3.1 “量-毒”曲线评价
通过spss 17.0软件绘制吴茱萸提取物对斑马鱼的“量-毒”曲线，如图1所示。经计算，吴茱萸提取物lc10为846.12 μg/ml。
3.2 斑马鱼肝脏组织结构评价
观察斑马鱼病理切片可知，吴茱萸提取物对斑马鱼肝脏造成明显损伤，其他脏器未见异常。表型图如图2-b所示，对照组斑马鱼肝脏组织、细胞完整，细胞质均匀，细胞核呈规则圆形，而经吴茱萸提取物暴露处理后的斑马鱼肝脏组织结构紊乱，细胞质减少，排列松散，空泡化严重。
3.3 斑马鱼体内细胞凋亡评价
ao具有膜通透性，使细胞核中dna和rna着色。在凋亡细胞中，染色质固缩或断裂形成凋亡小体，经ao染色后，荧光显微镜下呈绿色荧光[5]。染色结果如图2-c所示，与对照组相比，吴茱萸提取物组斑马鱼肝脏区域荧光明显增强，细胞凋亡增多，表明吴茱萸提取物能够诱导斑马鱼肝脏损伤，显著引起肝细胞凋亡（图2-c），其他脏器未见明显的细胞凋亡。
3.4 斑马鱼肝脏生化指标评价
alt和ast活性是传统评价肝毒性的标志物，且alt被视为肝脏损伤临床生化检测的“黄金标准”[6]，本实验以alt、ast为指标对斑马鱼幼鱼整体转氨酶水平进行评价。如图2-a所示，与对照组相比，经吴茱萸提取物暴露处理24 h后，各剂量组斑马鱼幼鱼整体ast和alt活性均显著升高（p＜0.01），并呈现剂量依赖性，且alt指标检测比ast更加敏感，与现有研究报道一致[7]。
3.5 rt-qpcr测定斑马鱼凋亡相关基因转录水平
本实验通过评价凋亡相关基因caspase-3、caspase-8和caspase-9的转录水平以考察吴茱萸提取物引起的肝细胞凋亡是否与caspase途径有关。如图3-a所示，经吴茱萸提取物处理后，caspase-3、caspase-8和caspase-9基因表达水平均呈现显著上升趋势（p＜0.01）。
3.6 western blotting检测斑马鱼caspase-3蛋白表达水平
如图3-b所示，与对照组相比，经吴茱萸提取物处理后，各剂量组斑马鱼caspase-3蛋白表达水平均显著升高（p＜0.01）。
3.7 代谢组学评价
将吴茱萸提取物组与对照组数据进行有监督的opls-da分析，2组区分明显，表明代谢轮廓存在差异（图4-a.a），随机置换测试（n＝100）结果见图4-a.b，以qy2＜0为评价标准，证明该评价模型具有良好的可信性和预测性。以vip≥1和p＜0.05为评判标准来寻找吴茱萸提取物组和对照组之间的差异代谢物（图4-a.c），基于共筛选得到的差异代谢物，通过kegg代谢通路富集分析来寻找吴茱萸的关键代谢通路（图4-b），并将不同代谢通路中所涉及到的差异代谢物分别归纳整理（表2）。
4 讨论
斑马鱼自身肝脏具有的一些优势特征，促使斑马鱼模型在肝毒性药物的高通量筛选中脱颖而出。斑马鱼的肝脏发育较快，同哺乳动物模型相比，具有高度遗传保守性，在肝脏组织结构和功能上与哺乳动物具有相似性[8-10]，因此，斑马鱼替代传统哺乳动物模型广泛用于药物诱导肝损伤的研究。此外，斑马鱼胚胎具有光学透明性的特点，相关转基因技术的发展也促进了斑马鱼在药物肝毒性高通量筛选中的应用[11-12]。斑马鱼幼鱼在确定肝毒性方面表现出了能与传统模型相媲美的能力，而且能够预先筛选具有潜在肝毒性效果的化合物[13-14]。
本实验基于斑马鱼模型，从病理组织学、生物化学和分子生物学等多方面技术整合评价吴茱萸提取物的肝毒性，发现吴茱萸毒性大小与暴露浓度呈现明显的剂量正相关性。通过建立吴茱萸提取物“量-毒”曲线，明确毒性剂量，并控制在亚致死量暴露条件下，通过病理组织切片和整体ao染色观察到毒性表型。结果表明，吴茱萸提取物对斑马鱼肝脏造成明显肝损伤，未见其他脏器损伤。与对照组相比，经吴茱萸提取物暴露处理后的斑马鱼幼鱼肝脏区域的荧光强度增强，提示斑马鱼幼鱼的肝脏组织出现明显的细胞凋亡；病理组织结果同样表明吴茱萸提取物暴露处理能够破坏斑马鱼肝脏组织结构，造成组织结构松散，肝细胞空泡化。同时评价了ast和alt肝功酶活性，结果表明吴茱萸提取物处理能使斑马鱼整体肝功酶活性显著增加。作为肝毒性评价的黄金标准，alt和ast通常在肝脏中蓄积，而在血液中的水平较低。本实验中吴茱萸提取物处理仍会显著增加斑马鱼幼鱼整体的肝功酶活性，因此，即使存在不同组织干扰的情况下，斑马鱼幼鱼的整体肝功酶评价仍可以作为斑马鱼幼鱼肝毒性评价的通用方法。
细胞凋亡是经一系列基因活化及调控细胞有序的、自主的主动死亡过程，通常由蛋白酶caspases介导蛋白裂解引起细胞凋亡[15]。caspase家族蛋白是一种直接诱导细胞转化解体的蛋白酶系统，内源性指向途径主要在由线粒体介导的细胞色素c中，细胞色素c被释放后立即与胞质中的caspase-9联合形成转化体，启动caspase-3在细胞凋亡过程中发挥调控作用。高转录水平的caspase-3、caspase-8和caspase-9是引起细胞凋亡的重要指示。rt-qpcr结果显示，斑马鱼幼鱼中3个凋亡基因的转录水平对吴茱萸提取物处理均表现出较强响应，呈现显著的上升趋势（p＜0.01）。western blotting也进一步验证了caspase-3蛋白表达水平显著上调（p＜0.01），结合ao染色后观察到的凋亡细胞增多，表明吴茱萸提取物能够诱导肝脏细胞凋亡的发生。
本实验采用非靶向代谢组技术探讨吴茱萸提取物暴露处理对斑马鱼整体代谢轮廓和代谢途径的影响，利用opls-da分析方法研究吴茱萸提取物对斑马鱼整体代谢轮廓的影响，确认与肝毒性相关的重要代谢物。结果表明吴茱萸提取物组和对照组之间存在显著的分离趋势。在此基础上，通过火山图来表示吴茱萸提取物组与对照组之间的差异代谢物，最终确定的差异代谢物主要包括氨基酸、碳水化合物及小分子酸、烷烃和含氮分子等小分子化合物，并逐个分析差异代谢物以探讨其潜在的毒性机制。最后，通过kegg途径分析确认吴茱萸提取物影响的代谢途径。
氨基酸是斑马鱼主要的能量基质，在斑马鱼不同的组织器官，尤其在肝脏中发挥着重要的生理功能[16]。细胞坏死、肝脏的吸收和内源性蛋白的降解都会影响氨基酸水平的变化[17-18]。实验结果显示，吴茱萸提取物处理后，斑马鱼幼鱼体内的氨基酸代谢水平发生显著变化，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，牛磺酸和次牛磺酸代谢途径受到显著影响。亚牛磺酸是牛磺酸合成的中间产物，在肝脏中胆汁酸与牛磺酸或甘氨酸结合，形成胆酸盐。因此，亚牛磺酸和甘氨酸的同时增加能够加速胆汁酸的分泌[19]。此外，在本实验研究中发现给药组斑马鱼核酸代谢发生紊乱，嘌呤作为核苷酸的重要组成部分，是储存能量的主要生物分子。黄嘌呤作为氧化应激损伤的重要生物标志物，也是嘌呤代谢的中间产物[20]。黄嘌呤的变化可能与三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，atp）含量降低有关，并且其最终会在脱氢酶的作用下转化成尿酸[21]。尿酸是细胞外液中一种有力的抗氧化物质，因此，黄嘌呤的增加和尿酸的降低意味着atp的产生受到干扰。
本研究结合斑马鱼幼鱼肝功酶活性、肝脏结构和细胞状态、凋亡基因和凋亡蛋白的表达水平等多指标整体评价了吴茱萸提取物对斑马鱼幼鱼肝脏的影响。结果发现，吴茱萸提取物损害斑马鱼幼鱼肝脏组织结构，肝功酶表达水平显著升高，上调凋亡相关基因和蛋白表达水平，诱导肝细胞凋亡，表明斑马鱼模型在中药肝毒性评价中具有适用性。通过gc-ms比较分析吴茱萸提取物对斑马鱼幼鱼整体代谢轮廓，结果发现，吴茱萸提取物扰乱斑马鱼幼鱼内源性代谢物水平，主要影响主要能源物质-氨基酸的代谢，最终造成斑马鱼幼鱼整体能量代谢紊乱，评价斑马鱼体内的氨基酸代谢水平，亦是未来斑马鱼模型评价药物肝毒性研究可以参考的思路和方法。本研究为支持斑马鱼模型作为一种新的工具来进行肝毒性中药筛选和预测提供支撑。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：范琦琦，李芝奇，陈美琳，魏 静，于啊香，宋若兰，董 英，姚鉴玲，折改梅，赵崇军．基于斑马鱼模型的吴茱萸提取物肝毒性评价 [j]. 中草药, 2022, 53(6): 1768-1775 .
北京中医药大学研究生(北京中医药大学研究生院)
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